Documenti (La Melatonina)

IL CLUB DI

LETIZIA

Dedicato alla lesione cerebrale infantile

A cura di Maria Simona Bellini


della Dott.ssa Nuccia Esposito, Roma (Italia)
Fino a circa 35 anni fa solo pochi ricercatori avevano studiato la ghiandola pineale, così che la sua funzione è rimasta poco conosciuta per molto tempo. Dalla metà degli anni '50 invece sono state condotte numerose indagini sperimentali che hanno fatto di questa un'area di intensa ricerca. I risultati di tali investigazioni hanno portato a chiarire che: 1) l'attività della ghiandola pineale è influenzata dalla fotoperiodicità ambientale; 2) la ghiandola sintetizza una sostanza che possiede funzioni ormonali: la melatonina; 3) la funzionalità del sistema riproduttivo dei roditori fotoperiodicamente dipendenti è connessa alla attività della ghiandola pineale; 4) l'innervazione simpatica che giunge alla ghiandola è importante affinché essa mantenga la sua attività biosintetica ed endocrina. Dalla metà degli anni '60 la ricerca sulla ghiandola pineale si è incrementata in maniera esponenziale, anche se comunque le prove che dimostrano che la melatonina è un ormone di origine essenzialmente pineale e che essa è responsabile delle manifestazioni endocrine della ghiandola sono venute più tardi.: Attualmente numerose evidenze sperimentali hanno suggerito che la ghiandola pineale è importantemente coinvolta nell'animale da esperimento nella regolazione della soglia al dolore, della soglia convulsivante, nei processi di invecchiamento cellulare, nella regolazione del ritmo sonno-veglia e nella modulazione della risposta a stimoli ansiogeni. Recentemente studi nell'uomo hanno indicato che alterazioni dell'attività della pineale sono associate a numerose patologie di tipo neurodegenerativo e psichiatrico, quali l'invecchiamento cerebrale, la delayed sleep-syndrome, i disturbi affettivi ad andamento stagionale (seasonal affective disorders), solo per citarne alcuni.

Fisiologia della ghiandola pineale

Sintesi della melatonina

Dal punto di vista biochimico è stato dimostrato che la ghiandola pineale è la maggiore fonte di melatonina nell'organismo. Tale ormone è un prodotto del metabolismo del triptofano. Il triptofano di derivazione ematica è convertito a 5-idrossitriptofano ad opera dell'enzima triptofano idrossilasi che trasferisce un gruppo idrossile nella posizione 5 dell'anello indolico per produrre il 5-HTP. Un secondo enzima, la decarbossilasi degli aminoacidi aromatici (Fig.), rimuove il gruppo carbossilico della catena laterale formando la 5-idrossitriptamina o serotonina (5-HT). Questa, ad opera dell'enzima N-acetiltransferasi (NAT), è trasformata in N-acetilserotonina che è successivamente convertita dall'enzima idrossi indol-o-metil-transferasi (HOMT) in melatonina. Si ritiene che l'N-acetiltransferasi, un enzima presente nella ghiandola pineale e nella retina, sia il fattore limitante della via biosintetica della melatonina (Klein e Moore, 1979).
Nella maggior parte delle specie animali studiate fino ad ora, la ghiandola pineale produce e secerne la melatonina con un caratteristico ritmo circadiano con i livelli più elevati di notte (Fig.1). Lo stimolo per l'incremento notturno della melatonina è generato dall'attività elettrica che si origina nei nuclei soprachiasmatici dell'ipotalamo e che giunge ai pinealociti attraverso le fibre nervose postgangliari simpatiche, i cui corpi cellulari sono situati nei gangli cervicali superiori. Nelle terminazioni nervose simpatiche che si trovano nella ghiandola pineale il maggiore neurotrasmettitore è la noradrenalina (NA). I potenziali di azione che giungono ai terminali nervosi durante la notte provocano la liberazione di noradrenalina nello spazio sinaptico. La noradrenalina così rilasciata nello spazio perivascolare pineale dalle terminazioni nevose simpatiche incrementa notevolmente l'attività dell'enzima NAT. La NA agisce sulla membrana del pinealocita stimolando i b1 adrenocettori. Tale stimolazione attiva l'enzima adenilato ciclasi attraverso una proteina regolatrice guanina nucleotide (Gs), promuovendo la sintesi dell' c-AMP. La stimolazione adrenergica notturna del NAT è strettamente correlata all'incremento dell' c-AMP. Si ritiene che l'incremento dei livelli di AMP ciclico medi l'induzione della NAT attivando una proteina chinasi AMP ciclico dipendente. Comunque, l'AMP ciclico promuove la trascrizione di m-RNA richiesto per aumentare i livelli di NAT e incrementare la N-acetilazione della serotonina. Esso serve a mantenere l'attività della NAT a livelli elevati, dal momento che l'aggiunta di un antagonista b adrenergico a pinealociti in cultura provoca un rapido declino dell'attività della NAT stessa (Klein ed al., 1978).

Dati recenti mostrano però che modificazioni dei tassi di AMP ciclico secondari alla liberazione di noradrenalina non sono mediati solo da un meccanismo b adrenergico, ma anche da un meccanismo a1 adrenergico. (Reiter, 1991).

La prima dimostrazione che ha permesso di asserire che gli a recettori adrenergici sono presenti nella ghiandola pineale, è stata fornita da studi che hanno dimostrato che la NA provocava un incremento del turnover del fosfatidilinositolo (PI), come accade in altri tessuti (Smith ed al., 1979). Successivamente studi di binding hanno identificato e caratterizzato questi recettori nella ghiandola pineale di ratto. Tali recettori hanno le caratteristiche farmacologiche tipiche del sottotipo a1, hanno un'alta affinità per la NA, sono localizzati sui pinealociti piuttosto che sulle terminazioni nervose simpatiche e sono presenti nel pinealocita con una densità paragonabile a quella dei b1 adrenocettori. L'attivazione dei recettori a1 adrenergici del pinealocita di ratto non aumenta di per se stessa la concentrazione di AMP ciclico, non stimola l'attività della NAT e di conseguenza non incrementa la sintesi di melatonina. Tuttavia, la stimolazione b1 adrenergica dell'AMP ciclico e del NAT è notevolmente potenziata dall'attivazione simultanea degli a1 adrenocettori. (Klein et al., 1983) E ciò è chiaramente comprensibile se si considera che la NA è un agonista che può attivare nei pinealociti sia i recettori a1 adrenergici che i b1.

Il meccanismo responsabile dell'amplificazione da parte dei recettori a1 della risposta indotta dalla stimolazione dei b1 recettori sembra coinvolgere la proteina chinasi c (PKC), una proteina chinasi fosfolipide- dipendente, attivata dal Ca++. E' stato osservato che gli agonisti a1 adrenergici sono in grado di incrementare la concentrazione di Ca++ intracellulare libero nei pinealociti probabilmente mediante l'apertura di un canale dipendente dal ligando e l'idrolisi del fosfatidil inositolo a cui seguono la produzione di diacilglicerolo e l'attivazione della PKC (Sudgen, 1989).

E' stato dimostrato che oltre alla NA anche il peptide intestinale vasoattivo (VIP), può attivare la NAT nella ghiandola pineale di ratto (Yuwiler, 1983). Il VIP si trova nelle terminazioni nervose all'interno della ghiandola pineale e sui pinealociti sono stati identificati e caratterizzati i recettori per il VIP (Kaku ed al., 1983). Il peptide intestinale vasoattivo induce nel pinealocita un rapido incremento dell'AMP ciclico, che è indotto dall'attivazione del recettore a1 adrenergico, apparentemente mediante lo stesso meccanismo che coinvolge la PKC nel promuovere la stimolazione b adrenergica dell'AMP ciclico. La stimolazione ad opera del VIP dell'attività della NAT è favorita anche dall'attivazione dell'adrenocettore a1 (Yuwler, 1987). Probabilmente il recettore b1 adrenergico ed il recettore del VIP sono accoppiati all'adenilato ciclasi di membrana attraverso la stessa proteina di legame guanina nucleoside (Gs). Tuttavia quale sia la natura e gli stimoli che causano il rilascio del VIP dalle terminazioni nervose della ghiandola pineale ed in quale maniera il VIP partecipi alla regolazione fisiologica della sintesi della melatonina non sono ancora chiare.

Oltre ai recettori adrenergici postsinaptici a1 e b1, e a quelli per il VIP numerosi altri recettori sia per neurotrasmettitori che per peptidi sono stati identificati nella ghiandola pineale dei mammiferi (Ebadi, 1993). L'elevato numero di recettori presenti nella ghiandola fa ritenere che la pineale riceva proiezioni nervose di natura differente da quelle dell'innervazione simpatica e suggerisce l'ipotesi di un loro potenziale coinvolgimento nel controllo degli eventi molecolari che modulano l'attività della ghiandola.

Fig.1.Andamento della produzione notturna di melatonina nel ratto.

Subito dopo la cessazione del periodo di luce i livelli di melatonina nella ghiandola pineale incrementano lentamente fino a raggiungere un picco a metà della fase di buio. Durante la seconda metà della notte i livelli di melatonina decrescono fino a raggiungere i livelli diurni che corrispondono all'inizio della fase di luce.

Recettori sigma
Recentemente è stata evidenziata la presenza di recettori sigma in elevate concentrazioni nella ghiandola pineale di ratto. Infatti, benché fosse stata già descritta la presenza dei recettori sigma nel cervello, prima d'ora non era stata ancora studiata la loro distribuzione nella ghiandola pineale. Studi autoradiografici hanno rivelato che tali recettori sono distribuiti sulla ghiandola pineale ad una concentrazione molto più elevata che in altre aree del sistema nervoso centrale (Jansen ed al., 1990).

Inizialmente i recettori sigma furono ritenuti sottotipi della famiglia dei recettori oppiacei, ma studi successivi dimostrarono che essi rappresentano siti indipendenti per l'azione di ligandi endogeni non ancora identificati. Difatti numerose caratteristiche farmacologiche servono a differenziarli dai recettori degli oppiati, mentre i recettori oppiacei sono enantioselettivi per gli isomeri (-) dei farmaci narcotici derivati dell'oppio e dei loro congeneri, i recettori sigma sono enantioselettivi per gli isomeri (+). Inoltre il naloxone è inattivo sia in vivo che in vitro nell'antagonizzare gli effetti dei ligandi sigma (Brady ed al., 1982; Iwamoto, 1981; Katz ed al., 1985). Perciò, è chiaro che il recettore sigma non è un tipo di recettore oppiaceo.

Successivamente i siti sigma furono identificati con i siti di binding della fenciclidina all'interno del canale ionico del recettore del glutammato del tipo N-metil-D-aspartato dal momento che la +N-allylnormetazocina (+SKF10,047), prototipo dei liganti sigma, era in grado di spiazzare la 3HPCP dal suo sito di legame (Mendelsohn ed al., 1985; Zukin ed al., 1984).

D'altra parte, l' [3H] (+)-SKF 10047 esibisce una selettività differente da quella della [3H] PCP , il che conferma che queste due sostanze si legano a recettori differenti. Per esempio, l'aloperidolo è in grado di spiazzare potentemente l' [3H] (+)-SKF 10047 dal suo sito di legame, mentre ha un'azione estremamente debole nel rimuovere la [3H] PCP dal suo sito di binding (Tam 1983). Alla stessa maniera la PCP esibisce una molto debole attività agonista nei confronti del binding dell'aloperidolo (Tam e Cook 1994).

In aggiunta i recettori sigma possono essere differenziati dai siti della fenciclidina anche in base alla loro differente distribuzione anatomica nel sistema nervoso centrale.

Tali studi hanno consentito concludere che l'[3H] (+)-SKF 10047 si può legare a due differenti siti: un sito ad alta affinità, sigma e un sito a bassa affinità, quello della fenciclidina.

In seguito studi di binding hanno rivelato che molti farmaci antipsicotici si legano con alta affinità ai siti sigma. L'aloperidolo è, tra gli antipsicotici, quello che esibisce la più alta affinità per i siti sigma inibendo il legame del SKF10047 con una Ki di 4mM (Itzhak 1988), cioè con una potenza almeno dieci volte maggiore rispetto a quella esibita nei confronti del D2 recettore dopaminergico. Sulla base di queste evidenze i siti sigma sono definiti aloperidolo sensibili e naloxone insensibili.

Ulteriori studi poi hanno dimostrato che l'agonista dell'autorecettore dopaminergico [3H](4)-3-(3idrossifenil)N-1propilpiperidina (3PPP) è in grado di legarsi a siti identici a quelli dell'SKF-10047, in esperimenti nei quali il sito della fenciclidina viene preventivamente bloccato (Largent 1986). Successivamente è stata individuata un'altra sostanza, il DTG (1,3di-o-tolilguanidina) con struttura chimica molto differente sia dal SKF10047 che dal 3PPP, capace di legarsi con alta affinità e con spiccata selettività ai siti sigma. Per quanto dapprincipio si è sostenuto la identità dei siti di binding del DTG, del 3PPP e dell'SKF10047 (Weber 1986), più tardi è stato chiaro che essi legano siti differenti. Difatti mentre il (+)3-PPP e l'aloperidolo esibiscono una affinità almeno 30 volte maggiore nello spiazzare il [3H]3-PPP dal suo sito di legame rispetto a quella esibita nello spiazzare il DTG, l'(+)SKF10047 esibisce una affinità nanomolare nei confronti del sito del [3H]3-PPP e micromolare nei confronti di quelli del [3H]DTG (Itzhak 1991).

Qusti risultati nel loro insieme suggeriscono l'esistenza di siti multipli di legame: il sito di legame del +3PPP, caratterizzato da marcata stereospecificità per gli (+) isomeri del benzomorfano indicato come s1 mentre il sito di legame del DTG, che esibisce ridotta o nessuna stereospecificità viene indicato come s2. La tavola 1 riporta le caratteristiche farmacologiche delle due popolazioni recettoriali, mentre nella tavola 2 sono riportate le aree di distribuzione nel sistema nervoso centrale del ratto dei recettori sigma 1 e 2.

Numerosi studi hanno tentato di identificare la localizzazione intracellulare dei siti sigma. Per esempio gli esperimenti condotti dal gruppo di McCann (1989) hanno indicato una sostanziale presenza di [3H](+)SKF10047 nella frazione microsomiale del cervello di ratto. Ulteriori tentativi tesi a differenziare la distribuzione subcellulare dei siti sigma1 e sigma2 e hanno portato a concludere che mentre la più alta distribuzione era nella frazione microsomiale per entrambi, pur tuttavia nella frazione mitocondriale, la concentrazione dei sigma1 era almeno doppia rispetto a quella dei sigma2 (Itzhak et al 1991b)

La relativamente alta densità dei siti sigma nella frazione microsomiale del cervello di varie specie ha spinto molti ricercatori ad ipotizzare una possibile associazione fra i siti sigma e citocromo P450 (Klein 1991; Ross 1991). Tuttavia va notato che contrariamente alla distribuzione a livello epatico, il contenuto del citocromo P450 nei microsomi rappresenta solo l'8% rispetto a quello presente nella frazione mitocondriale nel sistema nervoso (Min 1991). Pertanto appare molto improbabile che l'alta distribuzione di siti sigma a livello microsomiale nel sistema nervoso centrale possa avere un significato funzionale di associazione con il citocromo P450. Appare probabile che i siti sigma microsomiali possano rappresentare recettori neo-sintetizzati in viaggio verso la membrana cellulare, o al contrario recettori internalizzati a causa di fenomeni di endocitosi che portano a rimuovere le strutture alterate nell'ambito di un fisiologico processo di ricambio. Precisi studi sull'ontogenesi di tali recettori possono contribuire a chiarire tale problematica. Per i siti sigma presenti della frazione sinaptosomiale è possibile ipotizzare un coinvolgimento nella regolazione della sintesi di secondi messaggeri. Per i siti sigma presenti nella frazione microsomiale i dati al momento suggeriscono una funzione modulatoria nella regolazione dell'attività monoamino ossidasica (Y. Itzhak 1994).

Nonostante i numerosi studi condotti a tutt'oggi non è stato ancora possibile identificare una sicura funzione biologica per i siti sigma. La significativa concentrazione di siti sigma1 nelle vie mesolimbiche lascia ipotozzare un ruolo di tali siti di legame nella regolazione di alcuni comportamenti nell'uomo e nell'animale da esperimento e una loro disfunzione in alcune patologie psichiatriche.

Al contrario l'alta densità di sigma2 nelle aree preposte al controllo dei movimenti (cervelletto, nuclei del tronco, gangli della base) suggerisce un loro possibile ruolo funzionale nella modulazione dei movimenti e un loro coinvolgimento in alcuni disturbi motori. Purtroppo però, a tutt'oggi non è stata ancora identificata alcuna risposta biologica specifica derivata dalla stimolazione dei recettori sigma nelle aree cerebrali dove essi sono densamente distribuiti.

L'elevata densità di recettori sigma nella ghiandola pineale, superiore a qualsiasi altra area del sistema nervoso centrale, lascia ipotizzare un loro ruolo importante nella fisiologica regolazione dell'attività della ghiandola e suggerisce che tale struttura possa fornire un utile modello per lo studio di tali recettori. Pertanto nel presente studio, si è voluto investigare gli eventuali effetti prodotti dalla stimolazione in vivo del recettore sigma, attraverso l'utilizzazione dell'isomero (+) del benzomorfano N-allylnormetazocina cloridrato [(+)-N-allylnormetazocina] (SKF10047), un agonista con una specificità relativamente elevata per il sottotipo s1 (Walker, 1990).

Conclusioni
In questo studio si è voluto valutare il ruolo dei recettori sigma nella fisiologia della ghiandola pineale, osservando gli effetti del ligando per il recettore sigma (+)-N-allilnormetazocina sull'attività della ghiandola sia durante il giorno che durante la notte. La (+)-N-allilnormetazocina è in grado di promuovere l'incremento fisiologico sia dell'attività dell'N-acetiltransferasi pineale (NAT) che del contenuto di melatonina durante la notte, ma che essa non modifica l'attività biosintetica della ghiandola durante il giorno. L'incremento dell'attività notturna della NAT pineale indotto dalla (+)-N-allilnormetazocina è antagonizzato dal pretrattamento con rincazolo, un antagonista specifico per il recettore sigma . Questi risultati dimostrano che l'attivazione del recettore sigma da parte della (+)-N-allilnormetazocina non è in grado, di per sé, di stimolare la produzione di melatonina pineale, ma piuttosto è in grado di potenziare l'attività biosintetica della ghiandola pineale quando essa viene stimolata noradrenergicamente. Altresì il presente studio fornisce la prova di una possibile funzione dei siti sigma che sono distribuiti con elevata densità nella ghiandola pineale di ratto. In tale struttura essi appaiono essere implicati nel controllo della sintesi della melatonina. Se l'ipotesi suggerita da questi risultati è corretta, la risposta dell'attività della NAT e della sintesi della melatonina alla stimolazione potrebbe essere considerata semplicemente come uno strumento utile a caratterizzare il profilo farmacologico dei recettori sigma.

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